Annexin V凋亡试剂盒常见问题及解决方案

Q：Annexin V凋亡检测试剂盒的原理是什么？

A：Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合，将Annexin V标记荧光染料如FITC利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)或7-AAD可与双链DNA特异性结合，并产生强烈的荧光，正常情况下无法透过细胞膜。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，核染料PI或7-AAD可进入细胞内对DNA进行染色，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。

Q：Annexin V凋亡检测结果如何看？

A：

1.Annexin V^-PI^-—活细胞，Annexin V和PI都无法染上；

2.Annexin V⁺PI^-—早期凋亡细胞，细胞PS外翻与Annexin V结合，细胞膜完整，PI无法染上；

3.Annexin V⁺PI⁺—晚期凋亡或坏死细胞，细胞PS外翻与Annexin V结合，细胞膜受损，PI染料可以进入细胞内与DNA结合；

4.Annexin V^-PI⁺—裸核细胞，细胞膜结构丧失无法与Annexin V结合，PI可以进入细胞与DNA结合；

Q：如何统计凋亡细胞数？

 A：Annexin V凋亡实验在做凋亡统计时一般统计总的凋亡比例（早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞之和），也有文献统计细胞早期凋亡率。

Q：血液样本是否可以用于凋亡检测？

A：不建议检测血液样本，血液中血小板及很多免疫细胞自身存在PS外翻的情况，会影响检测结果。

Q：检测凋亡用的细胞能否固定？

A：甲醛固定液会造成结果假阳性，因此用于Annexin V凋亡检测的细胞不能进行固定。

需要注意的是，Annexin V检测的样本为外周血时，勿使用含有多聚甲醛等固定液成分的红细胞裂解液来处理细胞。

Q：Annexin V系列有很多种不同组合试剂盒，该如何选择？

A：挑选合适的Annexin V试剂盒，主要考虑两个方面：一是流式细胞仪的配置，二是细胞是否自带荧光（如转染了荧光的细胞、带荧光的药物来孵育细胞），在流式细胞仪配置允许的前提下，选择与细胞自发荧光使用不同检测通道的Annexin V试剂盒。

Q：说明书上写细胞量为1~5×10⁵，细胞量多的话对检测结果有没有影响？

A：建议细胞量最多不要超过10⁶个，过量的细胞相当于染料被稀释，影响染色和分离效果。一般2×10⁵个细胞足够进行凋亡检测了，通常情况下检测10,000个细胞就能得到比较好的结果。

Q：是否可以用PBS替代凋亡试剂盒里面的Binding Buffer？

A：不可以，Annexin V与PS的结合依赖Ca²⁺，Binding Buffer含有Ca²⁺，主要是促进Annexin V与PS的结合。不加Binding Buffer，会导致Annexin V的结合能力降低，造成阳性信号大幅下降甚至无阳性信号。

Q：如何设置补偿管？

A：实验设计时，考虑到补偿，建议设置全单染管调节补偿，如果样本有明显的自发荧光，且自发荧光对选择的染料有干扰，则必需设置一管只有自发荧光的细胞管(对于表达荧光蛋白的细胞，不加任何试剂的空白对照组作为EGFP的单阳组；对于有荧光的药物，细胞只加药物处理，作为药物的单阳组)，用来调节补偿，以扣除自发荧光对其它通道的干扰。

Q：染色完不能及时上机，样本能否固定？

A：细胞染色完成后，禁止固定，尽快检测，如无法立即检测，可将样本管放冰上，以减少外界环境对检测结果的影响，Annexin V结合不稳定，请务必在标记结束后半小时内检测。如果实验室距离上机的地方较远，建议将细胞和试剂盒带到上机的地方，染色后立即检测。

Q：凋亡检测中如何设置对照组？凋亡检测时细胞全部检测都是阳性是什么原因？

A：Annexin V凋亡检测中，阴阳性的界定不是依据空白组（细胞中不加PI也不加Annexin V），而且依据阴性对照组（细胞不经过药物处理，但是加入PI和Annexin V）。这是因为一般情况下，凋亡检测中，加入PI和Annexin V之后是不洗涤的，这意味着溶液有本底的荧光，阴性对照的信号比空白组高，如果以空白组来定阴阳性界限会出现大量假阳性细胞。

Q：细胞里有一个过表达载体，表达出绿色荧光蛋白EGFP，需要避开绿色通道，该如何选择凋亡试剂盒？

A：如果检测的流式细胞仪有DAPI通道，可以选择P-CA-248 Annexin V-APC/DAPI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，三种荧光之间没有补偿。如果没有DAPI通道，可以选择P-CA-208 Annexin V-APC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，但要注意合理设置单染管（包括只有自发荧光的细胞管，否则7-AAD通道信号会出现干扰），用来调节补偿。