实战分享 | 细胞内活性氧（ROS）水平测定之经验分享

氧化应激损伤在众多的疾病发生、发展和治疗过程中的作用越来越引起关注。活性氧（ROS）是细胞内引起氧化应激损伤的主要活性物质，因此对细胞内ROS水平进行测定是进行有关病理机制研究和治疗效果评价的重要实验内容之一。目前，最常用的测定细胞内ROS水平的方法是利用荧光探针DCFH-DA进行检测。 

一般来说，可以根据对细胞刺激时间不同，选择先装载探针再刺激（适合刺激时间较短的实验），或者先刺激再装载探针（适合刺激时间较长的实验）。经过多次实验，我们发现即使是刺激时间较短的实验，采用先刺激再装载探针的顺序，实验效果也会更好，因为刺激作用到细胞上需要一定时间才能使细胞产生相应的应激反应，而刺激后直接开始探针装载的20-30min期间就可以使细胞充分产生应激反应，更加节省时间。

由于测定细胞内ROS要充分保证细胞的活力和贴壁状态（尤其是用于荧光成像的样品），因此实验过程中的稀释液和清洗探针的缓冲液等最好全部使用无血清培养液。

ROS探针的荧光信号可以使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等多种方式进行检测。我们最常用的是共聚焦荧光显微镜，因为该方法在保证各组荧光成像参数条件一致的情况下，一方面可以提供可视化的荧光图像用于直观比较各组荧光信号强弱，另一方面可以通过平均荧光强度分析实现对各组细胞ROS水平的半定量分析。

利用共聚焦荧光显微镜进行荧光成像测定时，有时扫描第一遍时探针被激发的效果不好，可以在同一位置连续扫描三次及以上，使荧光分子被充分激发，再进行数据保存。

要想获取更加准确的荧光图像数据，方便后续进行平均荧光强度分析，就需要调整成像参数（主要包括激光强度、pinhole大小、信号增益值和扫描速度等）以控制好图像的荧光强度，防止图像过曝。通常我们会使用理论上荧光信号最强的实验组样品进行成像参数优化，随后对其他实验组也采用相同参数进行成像，以此确保获得的各组图像的荧光强度差异能够准确反应细胞内ROS水平差异。