细胞学堂 | 掌握这几种方法，轻松辨别细胞死活！
来源：Pricella 发布时间：2024-11-14 15:00:00
在细胞生物学研究中，准确区分活细胞与死细胞至关重要。掌握有效的细胞活性检测方法不仅能提高实验数据的可信度，还有助于我们深入了解细胞凋亡和坏死的机制。
本期细胞学堂将探讨活细胞与死细胞的定义、常用方法、实际应用中常见的问题和解决方案以及鉴别意义，为您的实验提供指导，帮助您顺利上手鉴别细胞。
死细胞与活细胞的定义
活细胞
指具有正常代谢功能和生理活动的细胞。这些细胞能够增殖、合成蛋白质、响应外界刺激，并保持细胞膜的完整性。
死细胞
指那些已经丧失生理活性，无法进行正常代谢，细胞膜结构发生破坏的细胞。这些细胞可能因缺氧、营养不足、毒素、机械损伤等多种因素形成。
鉴别死细胞和活细胞的常用方法
形态学观察
形态学观察是一种既直接又基础的细胞状态辨别方法。活细胞通常表现出特定的形态特征，如完整的细胞膜、清晰可见的细胞核以及细胞质内各类细胞器的有序排列。相比之下，死细胞也会出现明显的形态变化，如细胞膜破裂、细胞核消失和细胞质内容物外泄。这些特征可以通过光学显微镜或电子显微镜直接观察。
缺点：主观性强，结果受观察者经验影响，无法定量评估；且形态变化的出现需要一定的时间，限制了快速评估细胞状态的能力。
染色法
染色法是一种常用的鉴别细胞死活的方法，它通过特定化学染料的选择性渗透来区分活细胞与死细胞。常用的染色剂包括台盼蓝、伊红、苯胺黑等。
其中，台盼蓝染色法是其中最经典且广泛使用的细胞活性检测方法之一。该方法基于细胞膜的通透性进行区分：活细胞的细胞膜完整，能够阻止台盼蓝进入，而死细胞的细胞膜受到损伤，染料可自由渗透进入细胞质，从而使细胞染成蓝色。
缺点：该方法结果受观察者主观判断影响较大，可能会存在一定的误差，且只能粗略区分死细胞与活细胞，无法提供细胞死亡机制的具体信息。
基于酶活性的检测
细胞酶活性是活细胞的重要标志之一，活细胞中的特定酶具有催化底物反应的能力，而在死细胞中，这些酶的活性通常会丧失。因此，基于酶活性的检测方法也广泛应用于细胞活性的研究。常用的检测方法包括Calcein-AM/EthD-1双染法、MTT法、CCK-8法等。
以Calcein-AM/EthD-1双染法为例，Calcein-AM是一种脂溶性非荧光的膜透性染料，能被活细胞内的酯酶水解生成Calcein，在细胞中发出绿色荧光；而Ethidium homodimer-1 （EthD-1） 仅能渗透进入死细胞，与DNA结合后发出红色荧光。
缺点：染料成本较高，操作过程较复杂，且需要荧光显微镜或流式细胞仪等设备支持，这在一定程度上限制了其应用范围。
常见问题和解决方法
活细胞被误染为死细胞，或死细胞被误染为活细胞
原因
过高的染料浓度或过长的孵育时间可能会对活细胞造成损伤或引发应激反应，从而影响细胞膜的完整性，导致活细胞被误判为死细胞。相反，如果染料浓度过低、孵育时间不足，则可能导致死细胞被误判为活细胞。
建议
严格遵循推荐的染色条件，确保使用的染料浓度和染色时长适宜；优化实验条件，减少非特异性结合的可能性；此外，可以结合使用不同的染料和方法进行交叉验证，以提高染色的准确性和可靠性。
背景信号过高，荧光信号弱
原因
可能由于染色液中存在杂质，或细胞样品有细胞碎片和培养基残留，这些都会干扰信号，导致背景信号升高。此外，染料过期或受到污染、细胞活性降低，以及荧光显微镜的设置不当（如激发和发射波长不匹配）也可能影响结果。
建议
选用高纯度且新鲜的染色液，确保染料在有效期内，避免使用受污染的试剂；在染色前，采用适当的洗涤步骤去除培养基残留和细胞碎片，以减少背景信号的干扰；同时，优化荧光显微镜的设置，确保激发波长与染料匹配，并根据需要调整曝光时间，以提高荧光信号的强度和清晰度。
鉴别死细胞和活细胞的意义
确保实验的准确性
准确鉴别活细胞与死细胞对于实验的可靠性至关重要，它直接影响到数据的解读和结果的重复性。只有在明确细胞的状态后，我们才能有效评估实验结果和药物的作用，从而避免得出误导性结论。
细胞凋亡和坏死研究
在细胞凋亡和坏死的研究中，准确识别细胞的存活状态有助于揭示细胞死亡的机制。这种区分不仅有助于理解不同细胞死亡类型的生物学意义，还能为疾病模型的建立和新治疗策略的开发提供重要依据。
细胞培养和质量控制
在细胞培养和质量控制方面，定期监测细胞活性状态能够反映培养环境的稳定性情况，确保细胞的功能和质量。这对于生物制品的安全性和有效性至关重要，同时也提高了细胞培养过程的一致性和可重复性。
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以上是关于活细胞与死细胞鉴别的常用方法以及在实际应用中常见的问题和解决方案介绍，更多细胞培养干货，请持续关注细胞学堂专栏~
