细胞学堂 | 外泌体提取、鉴定方法
来源：Pricella 发布时间：2022-07-26 13:41:06
外泌体(Exosome) 指包含了复杂RNA和蛋白质的膜性囊泡，其直径在30-150nm左右。存在于所有生物体液中，包括血液、唾液、尿液、滑液、羊水、乳汁、细胞培养液等。不论是正常细胞还是肿瘤细胞，都能够产生外泌体。
外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，具有脂质双分子层结构；此外，外泌体还含有蛋白质和核酸。不同细胞来源的外泌体中所含有的生物分子具有细胞种属特异性，其外泌体特异性与来源细胞相符合。
外泌体提取方法
● 超速离心法：
目前外泌体分离的金标准，且为外泌体提取的最常用方法，方法成熟，适用于大体积样本。
● 沉淀法：
操作简单，快速，回收率高。
● 超滤法：
操作简单省时，可在低转速下得到外泌体，不影响外泌体的生物活性。
● 亲和层析法：
保证外泌体形态完整，特异性高，操作简单，无需特殊昂贵的仪器设备。
上述几种方法，方法一、二、三提取的纯度不够，方法四提取的量不够，我们可以将这两组方法综合起来，先用方法一、方法二、方法三粗略提取外泌体，再用方法四提纯外泌体。
外泌体获取
样本类型 | 样本体积 | NTA颗粒数 Particles/mL | 粒径分布nm | 蛋白量 ug |
细胞上清 | 1mL | 108-109 | 90-130 | ~10 |
血液 | 1mL | 1010-1011 | 60-100 | 200-400 |
外泌体鉴定
据国际细胞外囊泡学会（ISEV）在2014年的提议，外泌体鉴定3个标志：透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、粒径（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）、蛋白标志物（Western Blot, WB）。
TEM：
外泌体透射电镜分辨率为0.1~0.2nm，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，可观测样本中是否存在外泌体样结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球形，如图1），同时可测量外泌体大小。
图1. 电镜下的外泌体结构
NTA：
该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。
WB：
外泌体Western blot检测可含内参检测，外泌体中的β-Actin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低，外泌体WB检测时可能会检测不到任何条带或者条带微弱。
外泌体应用
外泌体作为药物载体，实现靶向给药。外泌体具有负载“货物“并将其传递给靶细胞的能力, 可用于细胞间通讯，尤其是远距离通讯。以外泌体作为药物转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强以及能跨越血脑屏障等独特优势。外泌体也适合递送各种化学物质、蛋白质、核酸等。Buller B等将负载 miR-146的外泌体注射至患有角质细胞瘤小鼠的肿瘤部位，发现miR-NAs有效的抑制了肿瘤的生长。
疾病诊断的分子标志物。不同疾病的不同类型细胞都能分泌含有不同miRNAs和RNAs的外泌体，使得从病人的体液中分离外泌体作为疾病诊断成为可能，尤其在肿瘤诊断中。除此之外，外泌体还可以应用于非肿瘤疾病的诊断。Welker M W等研究发现血清外泌体CD81可能是慢性丙型肝炎诊断的潜在蛋白标志物。
促进组织修复和再生。近年的研究发现，干细胞来源外泌体是干细胞旁分泌活动的一种重要方式，可介导其促进组织再生。Chen等发现，ADSCs-exo 的联合治疗可减少大鼠急性缺血性卒中的梗死面积，促进神经功能恢复。ADSCs-exo可以避免干细胞治疗的免疫排斥、伦理问题等缺点，且具有高稳定性、易于储存、无需增殖、便于定量使用等优势，与单一的细胞因子比较，具有较高的安全性和更大的组织再生潜能。
●参考文献●
