实战分享 | 中性粒细胞的高效分离技巧分享
来源：Pricella 发布时间：2024-08-07 13:42:00
中性粒细胞作为先天免疫系统中丰度最高的细胞之一，不仅参与天然免疫反应，还可以调节适应性免疫。随着深入的研究，人们发现，在肿瘤微环境中，受多种细胞因子的影响，中性粒细胞还会向N1、N2型肿瘤相关中性粒细胞的极化。相较于血液和腹腔，小鼠骨髓是一个便捷的中性粒细胞储存库。无论是在稳态下，还是在各种感染和非感染的炎症条件下，都可以分离出大量的中性粒细胞。
本期，我们非常荣幸地联系到了来自南昌大学的王老师，与我们分享她宝贵的科研经验。为了满足大量中性粒细胞的科研需要，王老师所在的课题组参照现有的文献，总结出一个较可靠的中性粒细胞的分离获取方法。接下来是王老师在中性粒细胞获取过程中积累的丰富经验和深刻心得，一起来实战学习吧！
❖ 作者单位：南昌大学
❖ 发表期刊：
Advanced Healthcare Materials（IF=10）
❖ 文章标题：
A Biomimetic Nanoplatform with Improved Inflammatory Targeting Behavior for ROS Scavenging‐Based Treatment of Ulcerative Colitis
❖ 引用普诺赛®产品：
产品名称 | 产品货号 |
RAW 264.7 (小鼠单核巨噬细胞白血病细胞) | CL-0190 |
Caco-2 (人结直肠腺癌细胞) | CL-0050 |
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中性粒细胞分离步骤
溶液配制
Percoll工作液（100% Percoll）：将10×HBSS缓冲液（不含钙、镁或酚红）与无菌Percoll原液按照1：9的比例（V/V）配成混合液。轻轻翻转几次，不要形成旋涡。
1×HBSS-0.38%柠檬酸钠缓冲液（250 mL）：将0.95 g柠檬酸钠溶于25 mL超纯水中，超声混匀，再加200 mL超纯水及25 mL的10×HBSS，超声混匀后4℃备用。
用Percoll工作液和1×HBSS-0.38%柠檬酸钠缓冲液配置52%、64%和72%的Percoll稀释液（溶液配制均在无菌环境下操作）。
中性粒细胞分离
选用7周的C57BL/6N小鼠，通过腹腔注射大肠杆菌K12中的脂多糖，以激活小鼠体内的中性粒细胞。
注射6 h后将小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，立即切下其后肢的胫骨和股骨，去除所有附着的组织和皮肤。将胫骨和股骨浸泡在1×HBSS-0.38%柠檬酸钠缓冲液中。
剪断胫骨股骨两端，用注射器向胫骨股骨中注入缓冲液，通过吹打得到骨髓细胞重悬液，一直吹到骨片泛白为止。
冲洗下来的骨髓细胞重悬液过70 μm尼龙筛网，230×g离心6 min，收集细胞。
弃上清，用2 mL缓冲液重悬细胞，再加缓冲液至40 mL，230×g离心6 min。
弃上清，将细胞重悬获得骨髓细胞液（2 mL）。
取一个新离心管，依次将浓度分别为72%、64%、52%的三种Percoll溶液轻轻加入干净的15 mL离心管中，将细胞悬液轻轻置于浓度为52%的Percoll溶液上。
4℃离心1545×g，30 min，收集Percoll溶液中浓度为64%和72%的细胞内容物。
吸取含有中性粒细胞的细胞液，加入1×HBSS-0.38%柠檬酸钠缓冲液，1545×g，5 min，弃上清，重复2次。
加入三倍体积的红细胞裂解液，轻轻吹打均匀，放置3 min，待红细胞完全裂解。
加入3 mL 1×PBS混匀后，1000 rpm，3 min离心。
弃上清，3 mL 1×PBS重复洗1次，得到小鼠骨髓中性粒细胞悬浮液，暂时不用，可冻存于-80 ℃。
获取的中性粒细胞可采用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等仪器进行表征。
注意事项
在处理小鼠前，可通过腹腔注射脂多糖（LPS-EK）到小鼠体内，以最大限度地提高中性粒细胞上粘附蛋白的表达。
剪断胫骨股骨两端后，用注射器向胫骨股骨中吹灌缓冲液这一步骤，建议选用较小的针头进行操作。同时，不要使用得到的骨髓细胞重悬液反复冲洗，以减少对细胞的机械损伤。
初步获取的骨髓细胞重悬液需先经70 μm尼龙筛网过滤，再进行下步操作。
加入不同梯度的分离液及骨髓细胞液时，操作要轻柔，一点一点加入。注意不同梯度的分离液之间分层要明确，肉眼可见到明显的分层时才可加骨髓细胞液，这一步是分离细胞成功的关键。
整个操作过程尽量在无菌环境下操作，减少微生物对细胞的污染。
非常感谢王老师关于中性粒细胞分离过程的经验分享，希望这些经验能对大家的研究工作有所帮助。同时，我们也热烈欢迎更多老师投稿，分享您在科研领域的干货和心得体会，共同促进科研交流和进步！
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