实战分享 | 骨髓源树突状细胞的提取和培养技巧分享
来源：Pricella 发布时间：2024-09-26 14:11:00
骨髓源树突状细胞（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDCs）是从小鼠或其他哺乳动物骨髓中分离，并经过体外特定条件诱导分化得到的树突状细胞（DCs）。它们是免疫系统中重要的抗原呈递细胞，能够识别、摄取和处理抗原，并通过表面分子将抗原呈递给T细胞，激活适应性免疫反应。因此，BMDCs是研究免疫反应、抗原呈递和细胞免疫调控的关键工具。
本期，我们非常荣幸地联系到了来自苏州大学的缪老师，与我们分享他宝贵的科研经验。接下来是缪老师在BMDCs提取和培养过程中积累的丰富经验和深刻心得，一起来实战学习吧！
❖ 作者单位：苏州大学
❖ 发表期刊：
Advanced Materials（IF=27.4）
❖ 文章标题：
A Minimalist Pathogen-Like Sugar Nanovaccine for Enhanced Cancer Immunotherapy
❖ 引用普诺赛®产品：
产品名称 | 产品货号 |
青霉素-链霉素溶液(双抗)，100× | PB180120 |
HEPES液(1M) | PB180325 |
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实验材料与试剂准备
实验材料
小鼠（常用C57BL/6，雌性，6-12周龄）
T75培养瓶（未TC处理），10 cm和6 cm皿，1.5 mL、15 mL和50 mL离心管，1 mL无菌注射器（带针）
提前灭菌（121℃，15-20 min）并干燥：剪刀、镊子若干，手术刀片及刀柄（熟练掌握可用），细胞筛网/纱布（250目）
试剂
完全培养基：RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素）
细胞因子：GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，20 ng/mL），β-巯基乙醇（50 μM）
红细胞裂解液：用于除去红细胞
PBS缓冲液（含1%青霉素/链霉素）：用于细胞的冲洗
弃上清，用2 mL缓冲液重悬细胞，再加缓冲液至40 mL，230×g离心6 min。
75%乙醇：用于活体消毒
流式抗体（CD11c、MHC-II、CD80、CD86、CD40等）：用于细胞表型鉴定
骨髓源树突状细胞的提取步骤
小鼠安乐死与骨髓提取
使用二氧化碳吸入法或颈椎脱臼法将小鼠安乐死；
将小鼠浸泡于75%乙醇，移至无菌环境下进行后续操作；
在无菌条件下，将小鼠置于无菌大皿中，从75%乙醇中转移至PBS缓冲液（含1%青霉素/链霉素）。接下来，从背侧将后腿部周围一圈的皮肉分离（两侧均需要处理），以充分暴露两侧股骨；
使用手术剪分离盆骨与脊柱（注意不要剪断股骨），并转移至中皿（PBS缓冲液含1%青霉素/链霉素）；
使用手术镊小心将皮毛与肌肉组织分离（拖拽至脚部即可）；
使用手术剪将胫骨周围一圈的肌腱剪断，使用两把手术镊分别固定脚部和胫骨，逆关节剥离，分离脚部和胫骨；
使用手术镊小心将胫骨处肌肉组织纵向剥离至股骨方向，暴露膝关节；
同上操作，使用两把手术镊分别固定股骨和胫骨，逆关节剥离，分离股骨和胫骨；
通过适当的力道逆关节方向用力，将股骨从髋臼（骨盆的部分）中脱离，进而分离股骨与骨盆；
使用手术剪和镊子仔细小心地将胫骨与股骨上的肌肉剥离，并暴露清晰完整的骨头末端；
待取出完整的两条胫骨和两条股骨之后，使用镊子固定骨头，剪刀剪断骨头两端，使用注射器吸取完全培养基，多次冲洗骨头中骨髓细胞，直至骨头发白无血红色；
随后将收集到的骨髓细胞重悬至15 mL离心管。
骨髓细胞处理与红细胞去除
将收集的骨髓细胞以1200 rpm离心3 min，去除上清；
重悬于1 mL红细胞裂解液中（37°C下处理1-3 min），轻柔混匀以裂解红细胞；
裂解后加入3 mL完全培养基中终止反应；
随后用细胞筛网或纱布过滤，去除骨屑和残余组织，将滤液收集到离心管；
再次1200 rpm离心3 min，去除裂解液。
树突状细胞的诱导与培养
细胞培养（第0天）
将骨髓细胞重悬于含有GM-CSF和β-巯基乙醇的完全培养基中（1-3 mL），取少量细胞悬液稀释100倍后计数；
将细胞接种在T75培养瓶中，细胞浓度为1.5-2×107个/30 mL/瓶，37°C，5% CO2孵育。
培养与补液（第3天）
轻轻拍打培养瓶使得半粘附状态的骨髓源细胞重悬以便于更好的与刺激因子接触并分化；
加入30 mL新鲜的完全培养基（含等浓度的刺激因子），继续培养。
细胞收获（第6天）
此时大多数细胞应已分化为未成熟的树突状细胞（未成熟树突状细胞通常表现为较低的表面MHC-II和共刺激分子表达，如CD80、CD86），轻轻拍打瓶身重悬半粘附状态的细胞，吸取1 mL含细胞的培养基；
收获的细胞进行PBS清洗，并通过流式细胞术染色鉴定；
BMDCs的标志物主要包括高表达的CD11c，以及MHC-II和共刺激分子（如CD80、CD86、CD40）的上调。以CD80、CD86为例，CD11c+细胞的比例在40%-60%，CD80+CD86+ in CD11c+ 细胞的比例在10%-20%，则代表分化程度和成熟度合适，可进行进一步实验；
鉴定完之后，收集T75瓶中的细胞悬液，以1200 rpm离心3 min，去除上清。重悬至完全培养基（不含刺激因子），稀释100倍计数，然后铺板（未TC处理）可直接进行后续实验；
以24孔板（未TC处理）为例，细胞浓度为0.5-1×106个/mL/孔，细胞在37°C，5% CO2孵育。
实验中的关键技巧与注意事项
提取骨髓源细胞过程中严格保持无菌环境，避免细胞污染，否则可能导致BMDCs成熟度过高无法使用。
提取过程中尽量将小鼠腿部及分离出的骨骼浸泡在PBS缓冲液（含1%青霉素/链霉素）中操作，避免长时间暴露在空气中。
分离腿部后可在中皿（PBS缓冲液含1%青霉素/链霉素）中操作，每一步均可更换全新的中皿（PBS缓冲液含1%青霉素/链霉素）。
在剪断骨头和冲洗细胞过程中（这一步骤直接接触细胞），需要使用灭菌后未被使用的剪刀和镊子，避免使用在前面的分离过程中使用过的器械，以防止交叉污染。
胫骨上端可直接被针头刺穿，可不剪，但需要检查是否破损，且其余骨头末端需要剪断部分不宜过多，以减少细胞损伤和污染风险。
注射器冲洗骨髓腔时，操作应反复轻柔，避免用力过猛导致细胞溅出或骨头破裂。
如遇到骨头破损或怀疑被污染的情况，可将这部分细胞单独培养并进行鉴定，以免污染其他正常细胞。
裂红时间需要控制得当，过长或过短都可能影响细胞质量。如遇到离心后仍有红色细胞沉淀可再次裂红，并酌情缩短裂红时间。
正常小鼠两条后腿提取的骨髓细胞量在3-6×107个（90 mL培养基，3瓶T75培养瓶），根据实验需求调整培养基体积和容器大小。
细胞因子的浓度可根据实际情况有所调整。正常骨髓源树突状细胞增殖和分化能力有限，避免长时间反复刺激。
BMDCs成熟度合适后应尽快使其脱离有刺激因子的培养基环境，在正常完全培养基中可存放1-3天，建议尽快使用，避免污染或过度成熟。
通过合理的培养条件与严谨的操作流程，可以成功诱导并提取出骨髓源树突状细胞。实验成功的关键在于控制细胞因子的浓度、及时补液以及细胞表型验证。掌握这些细节可以显著提高BMDCs培养的成功率，并确保所培养细胞具备期望的功能特性。
非常感谢缪老师关于BMDCs提取和培养过程的经验分享，希望这些经验能对大家的研究工作有所帮助。同时，我们也热烈欢迎更多老师投稿，分享您在科研领域的干货和心得体会，共同促进科研交流和进步！
