细胞学堂 | 细胞生长缓慢是异常状态吗？如何正确调整？
来源：Pricella 发布时间：2024-12-06 16:00:00
在细胞培养过程中，很多同学可能会产生这样的疑问：我培养的细胞为何生长得如此缓慢？是细胞被污染了吗？还是培养条件不合适？亦或是我的操作过程有误？实际上，细胞状态的识别和调整是细胞培养中非常重要的一环。
本期细胞学堂，我们将探讨导致细胞培养生长缓慢的五大常见原因，并提供一系列建议让细胞恢复到正常生长状态，为您的实验提供指导，让您能够轻松应对并调整细胞状态。
细胞本身生长较慢
某些细胞类型，如Caco-2（人结直肠腺癌细胞）和LNCaP clone FGC（人前列腺癌细胞），因其固有的生长特性，生长速度较慢，传代周期较长，导致它们的培养过程相对复杂且耗时。
以LNCaP clone FGC细胞为例，这一细胞不仅生长缓慢，还容易导致培养基迅速变酸。且该细胞生长过程中并不形成均匀的单层，而是倾向于形成集落。因此，传代后的48h内不应扰动。LNCaP clone FGC细胞在进行换液处理时，我们必须格外小心，避免对细胞造成扰动，确保集落能够稳定形成并维持细胞的正常生长。
总之，在培养这类生长缓慢的细胞时，我们必须密切关注细胞的生长状态，并根据需要适时调整培养条件，以提供一个最适宜的细胞生长环境。
细胞生长密度的影响
细胞生长密度是影响细胞生长的关键因素之一。当密度过高，细胞会竞争有限的营养和空间而导致细胞生长速度变慢。密度过低可能导致细胞间信号传递受阻、代谢活动异常及细胞群居效应减弱，不利于细胞的生长。
以HL-60（人原髓细胞白血病细胞）为例，它在高密度环境下生长更佳，而在低密度下则状态不佳。当HL-60细胞传代后生长速度缓慢且状态不佳时，可以尝试竖直放置培养瓶，提高细胞的局部密度。随着细胞密度的增加，其生长状态可能会改善。然而，并非所有细胞都像HL-60细胞偏爱高密度培养，RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）便是一个典型的反例，它们生长迅速，但一旦超过3天未传代，就会开始分化，导致形态、功能改变，增殖速度降低。
因此，为了确保细胞能够正常增殖和维持良好的生长状态，我们需要定期观察细胞生长状态，及时换液或传代，优化培养条件。
培养基的选择与适配
在细胞培养过程中，培养基的选择与适配对细胞生长至关重要。
对于C127 (小鼠乳腺肿瘤细胞) 、293T (人胚肾细胞) 和COS-7 (非洲绿猴SV40转化的肾细胞)等细胞，通常建议使用DMEM高糖培养基（葡萄糖浓度4500 mg/L）。低糖培养基可能会限制细胞生长，甚至可能导致细胞死亡。对于特定类型的细胞，如间充质干细胞，使用通用完全培养基可能因缺乏生长因子（如TGF-β、FGF2等）而限制细胞增殖[1]，因此，对于这类细胞，一般建议使用专为它们配制的用完全培养基。血清是细胞营养物质的重要来源，在选择培养基时，必须严格筛选血清产品，以确保细胞培养的稳定性和可靠性。此外，换液对于维持细胞营养充足同样重要，一般建议每2-3天换液一次，以防止营养成分耗尽和代谢废物积累，保护细胞免受损害。
除了营养成分和生长因子外，培养基酸碱度（pH值）也是影响细胞生长的重要因素。大多数细胞在pH值7.2至7.4范围内的环境生长最佳。但需注意不同类型细胞对pH值的要求存在差异。原代细胞培养对pH值的波动较为敏感，而细胞系则具有更强的适应性。为了监测培养基的pH值变化，通常会在培养基中加入酚红作为指示剂。若观察到培养基颜色发生明显的变化，如培养基颜色变黄，可以采取换液等相应措施，以确保细胞正常生长。
特别需要注意的是，培养基一旦开封，应尽快使用完，以防止保存不当或品质下降。若不能短时间用尽，建议进行分装储存，避免反复预热。在使用开封后的培养基时，如果发现其颜色与未开封的培养基相比发生明显变化，应先排查原因，确认是否由微生物污染所引起。若排除了污染的可能性，则可能是培养基缓冲体系发生变化导致pH值波动。此时，建议将培养基在培养箱中放置一段时间，让其达到新的平衡状态后再使用。
为了确保细胞的正常生长，建议选择与细胞类型相适配的培养基，并参考细胞培养说明书进行相关的培养操作。
实验操作的影响
在实验操作过程中，多个因素都可能影响细胞的生长。以下是对这几个关键因素的详细阐述：
胰酶消化
胰酶消化时间需适中。消化时间过长会损伤细胞，过短则可能导致细胞消化不充分，聚团、不易分离，进而影响细胞的贴壁和增殖能力。因此，应优化消化时间，注意镜下消化状态，以确保细胞损伤最小化，从而保障细胞的正常生长。
细胞冻存与复苏
细胞在冻存或复苏过程中若受到损伤，如冻存液不合适、冻存量较少、保存不当、复苏时解冻或放置太久等，都可能导致复苏后的细胞生长缓慢。因此，我们应严格按照规范进行操作，以减少细胞损伤。首次冻存某个细胞时，可以做冻存测试，确保复苏后的细胞能够正常生长。
悬浮振荡培养
对于悬浮振荡培养的细胞，摇床的振幅与转速控制至关重要。我们需要根据细胞类型和生长特性，调整至适宜的参数，以确保细胞在悬浮状态下能够正常增殖。
无菌操作规范
严格的无菌操作对防止微生物污染至关重要，我们必须使用无菌试剂和培养基，并定期清洁和消毒培养环境。一旦发现污染，应立即采取措施进行全面消杀。
因此，为确保细胞正常生长，我们需要从多个环节入手，不断优化实验操作并严格遵守无菌规范。
培养环境的影响
细胞培养环境对细胞生长至关重要，不适宜的环境可能导致细胞生长变慢，甚至死亡。关键环境因素包括：温度、二氧化碳和氧气等。通常，大多数细胞培养温度维持在37℃左右，过大波动将直接影响细胞生长状态；二氧化碳在维持培养液pH稳定方面起关键作用，浓度过低或过高均不利于细胞生长；同时，氧气也是细胞代谢关键要素，培养基溶氧不足会显著影响细胞的生长和存活。
因此，我们必须定期检查培养箱的温度和气体控制设备，确保环境因素处于最适宜水平，以保障细胞的正常生长。
综上所述，当细胞生长出现缓慢的问题时，我们需要系统地排查原因，并结合具体的实验情况，综合考虑细胞本身的特性、细胞密度、培养基以及操作细节，进行分析和相应调整。
以上是关于细胞生长缓慢的常见原因和解决方法详解，更多细胞培养干货，请持续关注细胞学堂专栏~
参考文献
[1]
Chu DT, Phuong TNT, Tien NLB, et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 2020 Jan 21;21(3):708. doi: 10.3390/ijms21030708. PMID: 31973182; PMCID: PMC7037097.
